實(shí)時(shí)熒光探針PCR技術(shù)，又稱為qPCR，是一種結(jié)合了PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)。它能夠在PCR反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特定DNA序列的擴(kuò)增情況。該技術(shù)主要依賴于熒光標(biāo)記的探針，這些探針能夠特異性地結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。

在PCR循環(huán)中，隨著目標(biāo)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，熒光信號(hào)也相應(yīng)增強(qiáng)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，因此可以通過熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。實(shí)時(shí)熒光探針PCR技術(shù)通常使用兩種類型的熒光探針：TaqMan探針和SYBR Green。

SYBR Green是一種DNA染料，它能夠非特異性地結(jié)合到雙鏈DNA上，具有使用簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。但其最大的缺點(diǎn)是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結(jié)合。因此，qPCR反應(yīng)中有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)會(huì)增加熒光值，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，而TaqMan探針法的出現(xiàn)很好地解決了染料法非特異性的問題，這也讓TaqMan探針法在檢測(cè)領(lǐng)域大放異彩！接下來，就讓我們了解一下TaqMan探針法qPCR在支原體檢測(cè)方面的應(yīng)用。

TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它含有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收。在PCR擴(kuò)增過程中，TaqMan探針與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，Taq DNA聚合酶的5'到3'外切酶活性會(huì)切割探針，導(dǎo)致報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光信號(hào)。切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度可以達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

檢測(cè)機(jī)制與定量分析?

根據(jù)檢測(cè)方式不同，PCR試劑盒分為?常規(guī)PCR?和?實(shí)時(shí)熒光定量PCR?兩類：

常規(guī)PCR檢測(cè)

擴(kuò)增后通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物大小，定性判斷目標(biāo)片段是否存在。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

熒光標(biāo)記?：加入熒光探針（如TaqMan探針）或DNA結(jié)合染料（如SYBR Green）；

信號(hào)監(jiān)測(cè)?：每輪擴(kuò)增后實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，通過?t值（熒光達(dá)到閾值所需循環(huán)數(shù)）定量起始模板量；

標(biāo)準(zhǔn)曲線法?：利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立Ct值與模板濃度的線性關(guān)系，計(jì)算樣品濃度

探針法qPCR在支原體檢測(cè)中的應(yīng)用

引物設(shè)計(jì)

針對(duì)支原體16S rRNA序列，下載后進(jìn)行序列比對(duì)，篩選支原體特異性的區(qū)段，尋找兩端特異中間保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)引物。一般選擇多對(duì)正反向引物，和多條相對(duì)應(yīng)的探針引物。

內(nèi)參設(shè)計(jì)

同時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)的有效性和穩(wěn)定性，往往還會(huì)設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)參引物和內(nèi)參熒光探針，用于監(jiān)控每次反應(yīng)過程的穩(wěn)定性。

反應(yīng)模板

檢測(cè)時(shí)需取培養(yǎng)至少2~3天的細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行核酸提取后，作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

目前市場(chǎng)上優(yōu)秀的qPCR支原體檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)支原體種類可達(dá)到39~180種以上，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10cfu/mL。

1高特異性：TaqMan探針通過與目標(biāo)DNA序列特異性結(jié)合，確保了檢測(cè)的高特異性。

2高靈敏度：該方法可以檢測(cè)極低濃度的核酸模板，靈敏度高。

3實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，可以準(zhǔn)確地定量分析。

4減少污染風(fēng)險(xiǎn)：由于不需要后續(xù)處理，減少了PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。

多重檢測(cè)能力：可以同時(shí)使用不同顏色的熒光標(biāo)記，進(jìn)行多重檢測(cè)。

5簡(jiǎn)化操作：制作成預(yù)混液后，大大簡(jiǎn)化操作步驟，易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。TaqMan探針法qPCR應(yīng)用于支原體檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)