原代肝細胞極為嬌貴，其凍存復蘇后的活性與功能高度依賴于冷凍過程。一個科學、溫和的梯度降溫方案是確保細胞在經(jīng)歷-196℃深低溫后仍能“復活”的關(guān)鍵。該方案的核心在于控制冰晶形成、減少滲透壓損傷，并最大限度地保護細胞膜和線粒體功能。

　　核心原則：規(guī)避“冰晶殺手”

　　快速冷凍會形成致命的細胞內(nèi)冰晶，刺穿細胞器。而梯度降溫的核心是讓細胞內(nèi)的水在受控狀態(tài)下緩慢地滲透到細胞外結(jié)冰，從而實現(xiàn)細胞的“生理性脫水”。

　　標準的梯度降溫方案實踐

　　前期準備：程序性凍存媒介是關(guān)鍵

　　將消化計數(shù)后的肝細胞重懸于預(yù)冷的、含10%DMSO和20-30%胎牛血清的專用凍存液中。DMSO能降低冰點，減少冰晶，但需控制濃度以減輕毒性。血清則提供豐富的營養(yǎng)和保護性蛋白。

　　使用程序性降溫盒是實現(xiàn)梯度降溫的標準裝備。

　　梯度降溫流程：四步鎖定高活性

　　第一步：4℃平衡。將分裝好的凍存管在4℃冰箱中靜置30-60分鐘，讓冷凍保護劑（DMSO）充分滲透進細胞。

　　第二步：-20℃至-40℃的“關(guān)鍵慢速下降”。此階段是冰晶形成和細胞脫水的核心窗口。將細胞轉(zhuǎn)移至程序性降溫盒，并置于-80℃冰箱；或使用程序降溫儀，以-1℃/分鐘的速率緩慢降溫至-40℃。此速率是保證細胞高質(zhì)量脫水的黃金標準。

　　第三步：-40℃至-80℃的快速過渡。在-40℃以下，細胞已完成脫水。此時可以加快降溫速度（約-5℃至-10℃/分鐘），迅速通過玻璃化轉(zhuǎn)化區(qū)，直至-80℃。

　　第四步：液氮長期儲存。在-80℃短暫停留后（不超過24小時），需迅速將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮氣相（約-150℃）或液相（-196℃）中進行長期儲存。

　　復蘇的協(xié)同作用

　　復蘇過程同樣關(guān)鍵，必須“快”字當頭：使用37-40℃恒溫水浴鍋快速復溫，并立即用預(yù)溫培養(yǎng)基稀釋以洗脫DMSO，從而與梯度降溫方案協(xié)同作用，最終實現(xiàn)原代肝細胞高達80%以上的復蘇存活率，為其后續(xù)的功能實驗奠定堅實基礎(chǔ)。